Cấu trúc của KTMD

Tất cả các KT đều có cấu trúc giống nhau gồm 4 chuỗi polypeptit. Hai chuỗi nhẹ kí hiệu là L và hai chuỗi nặng kí hiệu là H, gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S) (hình 21.7).

Chuỗi nhẹ: Trật tự axit amin của hai chuỗi nhẹ giống nhau và được chia làm hai vùng. Vùng có trật tự axit amin thay đổi gọi là vùng biến đổi (kí hiệu V_L), nằm phía đầu amin (-NH₂) của phân tử. Vùng có trật tự không thay đổi gọi là vùng cố định (ký hiệu C_L) nằm phía đầu cacboxyl (-COOH). Trật tự axit amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớp kháng thể, hoặc theo trật tự lamda hoặc theo trật tự kappa. Ngược lại, trật tự ở vùng biến đổi luôn khác nhau, kể cả ở các kháng thể do cùng một tế bào sinh ra.

Chuỗi nặng: Mỗi chuỗi nặng có 4 vùng axit amin : một vùng biến đổi và ba vùng cố định. Vùng biến đổi (kí hiệu là V_H) nằm phía đầu amin đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ tạo thành vị trí kết hợp KN (paratop). Vùng cố định nằm phía đầu cacboxyl, chia làm 3 vùng nhỏ có kí hiệu C_H1, C_H2 và C_H3. Giữa vùng C_H1 và C_H2 là vùng khớp nối có tác dụng như bản lề làm cho phân tử có hình chữ Y và có thể điều chỉnh cho hai paratop gắn với epitop của KN.

Dưới tác dụng của papain, phân tử KT bị phân giải tại vùng bản lề thành 3 mảnh: hai mảnh nhỏ chứa chứa toàn bộ chuỗi nhẹ và một nửa chuỗi nặng có đầu amin. Đây là nơi gắn với KN và được gọi là mảnh Fab (Fragment of antigen binding). Mảnh còn lại của chuỗi nặng phía đầu cacboxyl có thể kết tinh được gọi là mảnh Fc (Fragment crystalizable). Mảnh này có thể liên kết với đại thực bào, tế bào B và bổ thể.

Dưới tác dụng của pepxin thu được hai mảnh: Mảnh lớn gần như một kháng thể trọn vẹn với hai paratop và mảnh nhỏ thuộc phần Fc.

Các lớp kháng thể

Có 5 lớp kháng thể mang tên chuỗi nặng là IgG, IgM, IgA, IgD và IgE. Tính chất và đặc điểm của các kháng thể miễn dịch được ghi ở bảng dưới đây:

Đặc điểm	IgG	IgA	IgM	IgD	IgE
Tính chất vật lý
Khối lượng phân tử (×1000Da)	150	160	90	180	19
Số phân tử/đơn vị	1	1 hoặc 2	5	1	1
Chuỗi nặng	Γ	α	μ	Σ	ε
Chuỗi nhẹ	λ/K	λ/K	λ/K	λ/K	λ/K
Các chuỗi peptit khác	-	J+/- S	J	-	-
Dưới lớp	γ1, γ2, γ3, γ4	α1, α2	-	-	-
Nồng độ trong huyết thanh	10g/l (66%, 23%, 7%, 4%)	2g/l (85%, 15%)	1,2 g/l	0,03 g/l	200 ng/ml
Hoạt tính sinh học
Cố định bổ thể
Con đường cổ điển	Γ1, γ2, γ3	-	++	-	-
Con đường nhánh	+	+	-	-	-
Gắn với ĐTB	Γ1, γ3	+	-	-	+
Gắn với tế bào mast	-	-	-	-	++
Gắn với lympho hạt lớn	Γ1, γ3	-	-	-	-
Gắn với bạch cầu axit	γ1, γ3, γ4	-	-	-	+
Khuyếch tán ngoài mạch	γ1, γ2, γ3, γ4	+	-	-	+
Qua niêm mạc	-	++	+	-	-
Qua nhau thai	γ1, γ2, γ3, γ4	-	-	-	-

- IgG chiếm 80% tổng Ig trong huyết thanh người bình thường. Cấu tạo gồm chuỗi nhẹ Kappa hoặc lamda và hai chuỗi nặng gama. Ở người Việt nồng độ IgG trong máu là 1400 mg/100ml. IgG là kháng thể duy nhất được truyền từ mẹ sang thai nhi qua nhau thai. IgG giữ vai trò chính bảo vệ cơ thể chống tác nhân gây bệnh, đảm nhiệm các chức năng opsonin hóa (giúp đại thực bào bắt giữ KN), hoạt hóa bổ thể, gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc KT (giúp tế bào K diệt tế bào đích), trung hòa ngoại độc tố (độc tố uốn ván, độc tố do Clostridium botulinum gây ngộ độc thức ăn, nọc rắn, nọc côn trùng…), gây ngưng kết vi khuẩn và trung hòa

virut.

- IgM chiếm 5-10% trong huyết thanh ở người bình thường. IgM có cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda và hai chuỗi muy. Năm globulin chụm lại với nhau thành phân tử lớn hình sao năm cánh nhờ cầu nối disulfua và chuỗi protein J, do vậy có tới 10 paratop. IgM xuất hiện sớm, thực hiện các chức năng như hoạt hóa bổ thể, ngưng kết hồng cầu cùng loài trong trường hợp nhóm máu ABO, ngưng kết vi khuẩn.

- IgA có cấu tạo gồm 2 chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda với hai chuỗi nặng alpha. Có hai loại: IgA trong huyết thanh chủ yếu ở dạng mônome và IgA tiết (sIgA) luôn có dạng dime, có trong dịch tiết của cơ thể như sữa, nước bọt, nước mắt, trong dịch nhầy đường tiêu hóa, sinh dục, hô hấp. IgA monome làm nhiệm vụ hoạt hóa bổ thể theo con đường nhánh. IgA tiết chống vi khuẩn trên bề mặt niêm mạc gây nhiễm trùng đường hô hấp, tiêu hóa đồng thời chống KN nhóm máu ABO.

Hình 21.10: Cấu trúc IgA tiết

Mặc dù phần lớn IgA là monome nhưng IgA tiết là dime

- IgD có nồng độ trong máu rất thấp và cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda và hai chuỗi nặng delta. Hoạt tính sinh học của IgD còn chưa rõ nhưng nó có mặt trên tế bào B làm thụ thể cho KN.

- IgE có nồng độ trong huyết thanh rất thấp và có cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda và hai chuỗi nặng epsilon. IgE tham gia vào quá mẫn tức thì (hay dị ứng) bằng cách gắn phần Fc với tế bào mast (dưỡng bào) và phần Fab với kháng nguyên. Tế bào mast được hoạt hóa sẽ giải phóng các chất hoạt mạch như histamin, leukotrien, serotonin gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch.

Cơ chế hình thành kháng thể miễn dịch

Việc hình thành KT là một quá trình rất phức tạp đòi hỏi có sự tham gia của nhiều tế bào: tế bào T, tế bào B và tế bào trình diện KN (APC) và phải có mối tương tác giữa các phân tử bề mặt (TCR, MHC, kháng thể bề mặt tế bào B).

Khi KN vào cơ thể sẽ theo dòng máu và hệ bạch huyết vào hạch lympho, lách và gan. KT sẽ được tạo thành ở lách và hạch lympho. Trước hết KN phải được APC trình diện. APC là đại thực bào hoặc cũng có thể là tế bào B.

- APC là tế bào B thông qua thụ thể là KT bề mặt sẽ nhận diện KN. KN vào tế bào rồi tiêu hóa trong endoxom. Các peptit được tạo thành sẽ kết hợp với phân tử MHC-II đi ra bề mặt tế bào để tương tác với TCR.

- APC là đại thực bào cũng hoạt động như vậy nhưng không có thụ thể dành cho KN. Đại thực bào thâu tóm KN, tiêu hóa và giải phóng peptit. Peptit cũng gắn với MHC-II để đưa ra bề mặt trình diện tế bào T_H như trường hợp với APC là tế bào B.

Phức hợp MHC-II-KN sẽ được trình diện cho tế bào T_H thông qua TCR. Phân tử MHC cũng tương tác với thụ thể CD₄ trên mặt tế bào T_H. Được kích thích bởi KN, tế bào T_H hoạt hóa và tăng sinh, sản ra interleukin để kích thích tế bào B tăng sinh và biệt hóa thành tế bào plasma sản xuất kháng thể và dòng tế bào B nhớ. Tế bào plasma chỉ sống được khoảng một tuần nhưng lại sản một lượng lớn KT. Tế bào B nhớ có đời sống dài và tồn tại cả khi KN đã mất. Khi được khích thích bởi KN vào lần hai, chúng sẽ biến thành tế bào plasma để sản xuất KT nhiều nhanh chóng hơn. Đó chính là đáp ứng miễn dịch lần hai và là cơ sở của việc tiêm vacxin.

Một số KN có thể kích thích tạo thành KT ở mức độ thấp mà không cần có sự tham gia của tế bào T, được gọi là KN không phụ thuộc tuyến ức. Các KN này thường có cấu tạo đơn giản, lặp đi lặp lại như polyxaccarit. KT được tạo thành thường thuộc lớp IgM, có ái lực thấp. Tế bào B đáp ứng KN này không có trí nhớ miễn dịch.

Thuyết chọn lọc dòng của Burnette

Theo Burnette thì thông tin để hình thành KT đã phải có sẵn trong tế bào B từ trước khi có KN xâm nhập. Bằng con đường đột biến, hàng loạt loại tế bào B được tạo thành. Mỗi loại có khả năng đáp ứng với một loại KN. Trong thời kỳ bào thai, loại tế bào nào chống lại KN bản thân sẽ bị ức chế. Khi ra đời, cơ thể chỉ còn giữ lại các tế bào phản ứng lại KN lạ. Khi có KN xâm nhập, chúng sẽ chọn lọc tế bào nào phù hợp (có thụ thể phù hợp với quyết định KN) để kích thích, phân chia theo con đường gián phân tạo thành dòng. Các tế bào không phù hợp với KN thì không được kích thích để tạo dòng.

Thuyết chọn lọc dòng được công nhận vì nó giải thích được nhiều hiện tượng miễn dịch như dung nạp miễn dịch (không tạo KT chống KN bản thân) và trí nhớ miễn dịch.

Cơ chế di truyền của sự tạo thành kháng thể

Một vấn đề đặt ra là làm thế nào có thể có khả năng tạo ra một lượng lớn và đa dN 41;ng các loại KT đến như vậy để đáp ứng lại các loại KN muôn hình muôn vẻ. Nếu theo quan niệm trước đây, một gen mã hóa cho một protein (hoặc một chuỗi polypeptit) thì có thể phải cần đến hàng tỷ gen mới có thể sản xuất được một lượng khổng lồ các loại KT. Điều đó vượt quá tiềm năng gen của cơ thể. Ngày nay vấn đề này đã được giải thích nhờ phát hiện ra sự tái sắp xếp lại các trình tự ADN và ARN xảy ra trong quá trình biệt hóa tế bào B. Sự sắp xếp này đóng góp rất lớn vào việc tạo ra sự đa dạng của KT trong cơ thể. Muốn hiểu rõ cơ chế di truyền của sự tổng hợp kháng thể, chúng ta cần nghiên cứu chi tiết hơn cấu trúc kháng thể và sự sắp xếp lại gen.

- Cấu trúc kháng thể: các kháng thể khác nhau có trật tự sắp xếp các axit amin khác nhau ở vùng biến đổi. Trong vùng biến đổi lại có những vùng nhỏ có trật tự axit amin thay đổi rất mạnh, gọi là vùng siêu biến (HVR – Hypervariable region) chính là vị trí kết hợp với kháng nguyên.

Vùng biến đổi của chuỗi nhẹ cũng như chuỗi nặng có 3 vùng siêu biến, được mã hóa bởi các gen vùng biến đổi (gen V) nằm trên ADN của tế bào B trong quá trình chín ở tủy xương. Tại vùng siêu biến thứ 3 của chuỗi nặng còn có một vùng được mã hóa bởi gen riêng gọi là gen D (từ chữ diversity – đa dạng) và một vùng nối giữa vùng đa dạng (D) với vùng cố định (C_H) gọi là vùng nối (J) được mã hóa bởi gen J, ở chuỗi nhẹ không có vùng D. Vùng J nối giữa vùng V với vùng C_L, cuối cùng là vùng cố định được mã hóa bởi các gen C_L.

Mỗi vùng biến đổi được mã hóa bởi hai đoạn gen (tức exon): một đoạn gen biến đổi (V) trong đó có vùng siêu biến và một đoạn gen nối gọi là J (joining). Sợi ADN ban đầu dòng phôi nằm trên nhiễm sắc thể thứ 2 chứa khoảng 40 exon V_K và 5 exon J_K. Trong quá trình phát triển của tế bào B ở tủy xương, nhờ sự chọn lọc ngẫu nhiên để biểu hiện một đoạn exon J_K và một đoạn exon V_K trong mỗi tiền tế bào B, bằng cách tái sắp xếp lại ADN để có thể liên kết bất kỳ một exon J_K­ với bất kỳ một exon V_K nào (tức V_K1 và J_K2 ở hình 12). Vùng nối giữa hai exon V-J đã được tổ hợp sẽ mã hóa cho vùng HVR3 của vùng biến đổi. Ở vùng cố định của chuỗi nhẹ Қ chỉ có một exon (C_K) nằm ở gần vùng J. Khi phiên mã, toàn bộ locut gen tạo thành ARN tiền chất sau đó được cắt nối thành mARN gồm V-J-C hoàn chỉnh để mã hóa cho chuỗi nhẹ Қ của kháng thể.

Locut gen mã hóa cho chuỗi nhẹ λ nằm trên NST số 22 và quá trình tái sắp xếp và biểu hiện của nó cũng giống như đối với chuỗi nhẹ Қ. Có khoảng 30 exon V_λ, 4 exon J_λ và 1 exon C_λ.

Sự đa dạng của KT còn bao gồm sự tái sắp xếp ADN mã hóa cho chuỗi nặng, nằm trên NST số 14. Chuỗi nặng gồm 65 exon V_H, 6 exon J_H, ngoài ra còn có 27 exon nằm giữa vùng V và J gọi là exon D. Bước đầu tiên trong quá trình tái sắp xếp lại ADN là sự chọn lọc ngẫu nhiên một exon D nối lại với một exon J, tiếp đó là nối với exon V_H. Trong trường hợp này tạo nên tổ hợp các exon V-D-J hình thành chuỗi nặng HVR3. Sự tái tổ hợp các exon tạo ra các gen vùng biến đổi được xúc tác bởi phức hệ các enzym tái tổ hợp recombinaz V(D)J.

Trong các tế bào B chưa chín (tức các tế bào chưa được hoạt hóa bởi các KN), các sợi ARN tiền chất được cắt nối, sao cho đoạn gen vùng biến đổi được nối với đoạn gen vùng cố định C_µ ví dụ C_γ, C_α, C_µ, C_δ hoặc C_ε để tạo ra các phân tử tương ứng IgG, IgA, IgM, IgD hoặc IgE.

Nguồn gốc của sự đa dạng

Các yếu tố đóng vai trò quan trọng để hình thành tính đa dạng của KT ở động vật có vú được liệt kê ở bảng sau:

Sự đa dạng của các vùng mã hóa cho kháng thể
Các gen dòng phôi	Các exon V, D và J
Sự tái sắp xếp các exon	Sự chọn lọc ngẫu nhiên các exon V, D và J, tái sắp xếp để biểu hiện.
Đa dạng của sự kết nối	Sự gắn các nucleotit sai hoặc cài xen các nucleotit vào điểm nối V-D-J.
Tái tổ hợp chuỗi H và L	Sự lựa chọn độc lập các gen vùng biến đổi của chuỗi nhẹ và chuỗi nặng trong mỗi tế bào B.
Đột biến xoma	Đột biến điểm trong các gen vùng biến đổi của tế bào B hoạt hóa.

Sự đa dạng được mã hóa trong genome lưỡng bội và được hình thành nhờ sự chọn lọc ngẫu nhiên của các exon V, D và J trong mỗi tiền tế bào B. Hơn nữa sự đa dạng trong HRV3 được tạo thành trong quá trình liên kết các đoạn V và J hoặc V, D và J do sự tạo thành một cách ngẫu nhiên các biến dị trong trình tự nucleotit của tổ hợp gen mới. Những biến dị này được tạo thành do được chèn thêm hoặc mất đi các nucleotit, dẫn đến mã hóa cho axit amin khác, tạo ra đột biến điểm, có thể làm thay đổi cấu hình của KT.

Một điều cần chú ý là sự chọn lọc và tái sắp xếp của các exon chuỗi nặng V, D và J và các exon chuỗi nhẹ V và J, xảy ra hoàn toàn độc lập với nhau. Điều này dẫn đến sự đa dạng rất lớn về các vị trí liên kết KN (paratop), đưa đến sự đa dạng về tính đặc hiệu của KT với KN. Ví dụ 2 tế bào B biểu hiện các vùng V_H giống hệt nhau có thể nhận các vùng V_L hoàn toàn khác nhau và do đó chúng đặc hiệu với các KN khác nhau.

Mức độ cuối cùng của sự đa dạng xẩy ra trong các tế bào B hoạt hóa và tăng sinh trong đáp ứng miễn dịch. Điều này bao gồm đột biến điểm (thay thế các nucleotit trong quá trình sao chép ADN) đặc biệt là trong các trình tự mã hóa cho HVR có thể dẫn đến sự thay đổi các gốc axit amin gắn với KN. Trong một số trường hợp đột biến xoma này tạo ra các tế bào B với thụ thể có ái lực cao với KN, sau đó các tế bào B này mới được chọn lọc trong trung tâm mầm để hoàn thiện thành tế bào plazma hoặc tế bào B nhớ.

Sự loại trừ alen và chọn lọc dòng

Sự tái sắp xếp các gen của KT trong qúa trình biệt hóa tế bào B không phải luôn thành công. Ví dụ có sự sắp lại các gen tạo thành tổ hợp không mã hóa cho chuỗi nặng và chuỗi nhẹ hữu hiệu. Tuy nhiên mỗi tiền tế bào B có một số cơ hội tạo thành các tổ hợp có ý nghĩa do chúng có 2 alen trong mỗi gen của genome lưỡng bội, cùng với khả năng sử dụng 2 loại chuỗi nhẹ (kappa và lamda). Thứ tự tái sắp xếp bắt đầu với mỗi alen của chuỗi nặng và tiếp sau đó là các alen của chuỗi nhẹ kappa và cuối cùng, nếu cần thiết là các alen của chuỗi nhẹ λ. Một sự tái sắp xếp đúng sẽ ngăn chặn sự tái sắp xếp khác cùng loại. Ví dụ nếu một alen của chuỗi nặng được sắp xếp thành công thì alen c ủa chuỗi nặng khác sẽ không bao giờ được sử dụng trong tế bào B đó và một alen chuỗi lamda sẽ chỉ được sử dụng nếu cả hai đều tiến hành tái sắp sếp lại các alen chuỗi Қ nhưng không tạo ra tái tổ hợp hữu hiệu.

Sự loại trừ alen này đảm bảo rằng tất cả các KT bề mặt (trên tế bào B) hoặc KT tiết (IgA) được sinh ra từ tế bào B đều có vùng V_H và V_L giống nhau và do đó đều đặc hiệu với cùng một KN. Điều này giải thích cơ sở di truyền của các ĐƯMD đặc hiệu với KN được tăng lên bởi sự chọn lọc dòng, được mô tả ở phần 5.4. Điều đó có nghĩa là khi các tế bào lympho B có thụ thể (BCR) phù hợp nhất với epitop của KN sẽ được kích thích để hoạt hóa và phân chia tạo nhiều tế bào cùng loại, gọi là một dòng. Trong một số trường hợp có nhiều tế bào cùng được kích thích để phân chia dẫn đến đáp ứng đa dòng chứa các phân tử KT có ái lực khác nhau đối với epitop. Các KT được tạo thành trong ĐƯMD thứ cấp (lần 2) thường có ái lực cao và được ưu tiên nhân rộng tạo thành một dòng phù hợp nhất với một KN.

Các đáp ứng đơn dòng (monoclonal) và ít dòng (oligoclonal) thường được coi là trường hợp đặc biệt, ví dụ ở bệnh u tủy (myelomatosis) trong quá trình phục hồi sau ghép tủy xương hay khi lai tế bào plasma sinh KT với tế bào u tủy để tạo dòng tế bào lai đơn dòng (monoclonal hybridoma).

Kháng thể đơn dòng

Trong tự nhiên, KN có nhiều epitop do đó khi đưa vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo ra nhiều KT. Muốn nhân một loại KT thì phải tiến hành tách chiết, vừa khó khăn vừa tốn kém. Năm 1975 lần đầu tiên Köhler và Milstein mô tả phương pháp tạo KT đơn dòng bằng cách lai tế bào plasma với tế bào u tủy. Tế bào plasma có khả năng tạo KT nhưng không nhân lên được trong môi trường nhân tạo, vì chúng là tế bào đã biệt hóa tận cùng. Ngược lại tế bào u tủy có thể phân chia rất nhanh, nhưng không có khả năng tạo KT. Tế bào lai sẽ được ưu điểm của hai loại tế bào trên: vừa có khả năng tạo ra KT, vừa phân chia rất nhanh trên môi trường nhân tạo.Nhưng tế bào lai này giống như các tế bào plasma đặc hiệu KN ban đầu, sẽ là đa dòng. Nhưng nếu pha thật loãng, rồi rỏ vào các giếng của bản nhựa, sao cho mỗi giếng chỉ có một tế bào riêng lẻ, rồi cho phân chia thì sẽ được một dòng tế bào có khả năng tạo ra một loại KT đặc hiệu với một loại epitop KN mong muốn. Do vậy người ta định nghĩa KT đơn dòng là KT do một dòng tế bào B sinh ra để đáp ứng đặc hiệu với một epitop KN.

Ngày nay, KT đơn dòng được sử dụng rộng rãi bao gồm việc định loại vi sinh vật và xác định các tế bào biểu hiện các dấu ấn (marker) bề mặt khác nhau sử dụng trong y học thực hành, ví dụ theo dõi, quản lý các KT kháng CD3 đối với bệnh nhân ghép thận để ức chế tế bào T gây thải ghép, sử dụng để xác định doping trong thể thao, xác định liều lượng thuốc trong ngành dược.