Xem Thêm: Ultimate Spider-Man: Season 2
Nhân vật chính của phim là cậu học sinh trung học Peter Parker vô tình bị một con nhện đặc biệt cắn và trở thành siêu anh hùng, sở hữu những sức mạnh đặc biệt. Sau cái chết của người chú đáng kính Ben, Peter rong ruổi trên khắp nẻo đường New York để bắt những tân tội phạm.
Một năm sau, cậu gặp Nick Fury và tham gia vào tổ chức S.H.I.E.L.D cùng với các siêu anh hùng khác.