QUYẾTĐỊNH của Bộ trưởng
BỘNÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
Vềviệc Ban hành tiêu chuẩn ngành về phương pháp kiểm tra phân vi
sinhvật kị khí cố định nitơ và phân giải xenlulo (445-2001)
BỘTRƯỞNG BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
Căn cứNghị định số 73/CP ngày 01 tháng 11 năm 1995 của Chính phủ quy định chức năng,nhiệm vụ, quyền hạn và tổ chức bộ máy của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nôngthôn;
Căn cứNghị định 86/CP ngày 08 tháng 12 năm 1995 của Chính phủ quy định phân côngtrách nhiệm quản lý Nhà nước về chất lượng hàng hoá;
Xét đềnghị của ông Vụ trưởng Vụ Khoa học Công nghệ và Chất lượng sản phẩm,
QUYẾTĐỊNH:
Điều1: Nay ban hành tiêu chuẩn ngành sau:
10TCN:445-2001 Phương pháp kiểm tra phân vi sinh vật kị khí cố định nitơ và phân giảixenlulo gồm 3 mục 14 diểm.
Điều 2: Quyết định có hiệu lực sau 15 ngày kể từ ngàyký
Điều 3: Các ông Chánh Văn phòng, Vụ trưởng Vụ Khoa họcCông nghệ và Chất lượng sản phẩm, các tổ chức, cá nhân có liên quan chịu tráchnhiệm thi hành Quyết định này./.
TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN ..........
1/ Phạmvi áp dụng:
Tiêu chuẩnnày áp dụng cho việc kiểm tra mật độ các vi sinh vật có khả năng cố định nitơhoặc phân giải xenlulo kị khí trong phân bón vi sinh vật.
2/ Thuậtngữ, định nghĩa:
2.1. Phân visinh vật (gọi tắt là phân vi sinh) là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinhvật sống hữu ích đã được tuyển chọn có mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hànhthông qua các hoạt động sống của chúng trong đất tạo nên chất dinh dưỡng mà câytrồng có thể sử dụng được (N, P, K) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nângcao năng suất và chất lượng nông sản. Phân vi sinh vật không gây ảnh hưởng xấuđến chất lượng nông sản, người, động vật, thực vật và môi trường sinh thái.
2.2. Phân visinh vật kị khí cố định nitơ là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vậtsống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành, có khả năngcố định nitơ trong điều kiện kị khí, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chấtlượng sản phẩm. Các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, độngvật, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
2.3. Phân visinh vật kị khí phân giải xenlulo là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinhvật sống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành, có khảnăng phân giải xenlulo trong điều kiện kị khí, tạo điều kiện nâng cao năng suấthoặc chất lượng sản phẩm. Các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người,động vật, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
2.4. Vi sinhvật đã được tuyển chọn là vi sinh vật đã được nghiên cứu, đánh giá hoạt tínhsinh học và hiệu quả đối với đất, cây trồng dùng để sản xuất phân vi sinh vật.
2.5. Vi sinhvật tạp là vi sinh vật có sẵn trong phân vi sinh vật nhưng không thuộc loại visinh vật đã được tuyển chọn.
3/ Nộidung, phương pháp:
3.1.Trang thiết bị:
Tủ sấy(thiết bị tiệt trùng khô) và nồi hấp áp lực (thiết bị tiệt trùng ướt)
Tủ ấm
Tủ cấy vôtrùng
Cân kỹ thuậtcó độ chính xác tới 0,01g
Que cấy
Que gạt thủytinh
Ống nghiệm thủy tinh
Ống đong
Bình tamgiác
Đĩa petri(hộp lồng)
Pipet chiađộ, pipetman
Đèn cồn hoặcđèn gas
Dụng cụ lấymẫu phải là loại thép không gỉ hoặc bằng thuỷ tinh.
Dụng cụ nuôicấy kị khí: có thể sử dụng một trong các dụng cụ sau:
Tủ nuôi kịkhí
Bình chânkhông
Bình nuôi kịkhí: Gas Pak
3.2. Tiếnhành:
3.2.1. Chuẩnbị dụng cụ:
Các dụng cụlấy mẫu và dụng cụ dùng trong xác định vi sinh vật phải tiệt trùng bằng mộttrong các phương pháp dưới đây:
Trong tủ sấyở nhiệt độ 160 - 1750C không ít hơn 2 giờ.
Trong nồihấp áp lực 1 at (1210C) không ít hơn 20 phút.
3.2.2. Chuẩnbị môi trường:
3.2.2.1. Môitrường dùng để kiểm tra phân vi sinh vật kị khí cố định nitơ, phân giải xenlulophụ thuộc vào chủng loại vi sinh vật mà nhà sản xuất sử dụng. Nếu không có yêucầu của nhà sản xuất, khi kiểm tra sử dụng môi trường (phụ lục kèm theo).
Môi trường đượcpha chế theo thứ tự các hoá chất trong thành phần đã cho. Sau đó phân phối vàocác dụng cụ thuỷ tinh đã chuẩn bị trước rồi khử trùng ở những điều kiện phùhợp. Để nguội môi trường đến 45-500C rồi phân phối vào các đĩa petrivô trùng. Thao tác này được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Kiểm tra độsạch của môi trường sau 2 ngày ở nhiệt độ từ 28 đến 300C. Chỉ sửdụng các đĩa petri chứa các môi trường nuôi cấy vi sinh vật không phát hiệnthấy tạp nhiễm.
3.2.2.2.Dịch pha loãng là nước muối sinh lý (NaCl 0,85%), không chứa các hợp chất nitơ,sau khi khử trùng có độ pH là 7,0.
Phân phốidịch pha loãng vào các ống nghiệm, bình tam giác có dung tích thích hợp với mộtlượng sao cho sau khi khử trùng, mỗi ống nghiệm chứa 9ml, mỗi bình tam giácchứa 90ml. Làm nút bông và khử trùng ở 1 at (1210C) trong 30 phút.
Nếu chưa sửdụng ngay, dịch pha loãng cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-100C,thời gian bảo quản không quá 1 tháng kể từ ngày chuẩn bị.
Ghi chú: Để tránh làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật dothay đổi nhiệt độ đột ngột, nên điều chỉnh nhiệt độ của dịch pha loãng đếnnhiệt độ phòng thử nghiệm trước khi sử dụng.
3.2.3. Lấymẫu:
3.2.3.1. Quyđịnh chung:
Việc lấy mẫuđược tiến hành sao cho mẫu kiểm tra phải là mẫu đại diện cho cả lô hàng. Ngườilấy mẫu phải được huấn luyện và có kinh nghiệm trong việc lấy mẫu.
Trong quátrình lấy mẫu, vận chuyển và xử lý mẫu, phải đảm bảo tránh sự lây nhiễm từ bênngoài và phải đảm bảo là mẫu phải được giữ nguyên trạng như ban đầu cho tới khiđem phân tích trong phòng thí nghiệm.
Không đượcbổ sung thêm bất cứ một tác nhân bảo quản, diệt khuẩn hoặc diệt nấm nào vào mẫukiểm tra.
Mẫu được lấyphải từ các bao nguyên gói.
Phải tiếnhành lấy mẫu ở những nơi không có hơi nước nóng, hoá chất độc hại, không có ánhnắng gay gắt hoặc bụi và được đưa ngay vào dụng cụ chứa mẫu.
Các dụng cụlấy mẫu và chứa mẫu phải vô trùng.
3.2.3.2. Sốlượng mẫu:
Lô hàng baogồm các bao (túi) được sản xuất cùng một đợt với cùng một nguồn nguyên liệu.
Số lượng bao(túi) cần lấy để kiểm tra đối với mỗi lô hàng phụ thuộc vào độ lớn của lô hàngđó và phù hợp với qui định trong bảng 1
Bảng1: Số lượng bao (túi) cần lấy để kiểm tra
| Cả lô hàng (bao, túi) | Số lượng mẫu cần lấy (bao, túi) |
| Đến 100 Từ 101 đến 1000 Từ 1001 đến 10000 Lớn hơn 10000 | 7 11 15 19 |
Các bao(túi) mẫu được lựa chọn ngẫu nhiên theo TCVN 1964-75
Tiến hànhlấy mẫu trung bình từ mẫu chung là tập hợp các mẫu ban đầu trong lô hàng kiểmtra. Chia mẫu trung bình làm 2 phần bằng nhau rồi bao gói phù hợp với yêu cầucủa sản phẩm. Một phần dùng để kiểm tra và một phần để lưu và bảo quản trongđiều kiện qui định mà mỗi loại sản phẩm yêu cầu để dùng khi phân tích trọngtài. Trên mỗi gói mẫu phải có nhãn ghi rõ:
Tên mẫu vàđối tượng cây trồng được sử dụng
Tên cơ sởsản xuất
Thời giansản xuất
Thời gian vàđịa điểm lấy mẫu
Tên ngườilấy mẫu, cơ quan lấy mẫu.
3.2.4. Kiểmtra:
3.2.4.1. Mậtđộ vi sinh vật kị khí cố định nitơ:
3.2.4.1.1.Pha loãng mẫu:
a/ Đối vớimẫu dạng lỏng: Dùng pipet vô trùng lấy 10ml mẫu cho vào 90ml dịch pha loãng đãchuẩn bị sẵn (xem 3.2.2.2), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng. Trộn kỹ bằngcách dùng một pipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộncơ học trong 5-10 giây. Dung dịch tạo ra được gọi là dung dịch huyền phù banđầu.
b/ Đối vớimẫu dạng bột: Cân 10g mẫu có độ chính xác tới 0,01g và cho vào 90ml dịch phaloãng đã chuẩn bị sẵn (xem 3.2.2.2). Trộn kỹ bằng dụng cụ trộn cơ học từ 5 đến10 phút sao cho có được một dung dịch có phân bố đồng đều, để lắng các phần tửnặng trong khoảng 15 phút, gạn được dung dịch huyền phù ban đầu.
c/ Dùngpipet đã vô trùng hút 1ml dịch huyền phù ban đầu (a hoặc b) cho vào 9 ml dịchpha loãng, tránh chạm pipet vào dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng cách dùng mộtpipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học trong5-10 giây, để có dịch pha loãng mẫu có nồng độ là 10-2. Lặp lại cácthao tác này để thu được dịch pha loãng đối phân vi sinh vật trên nền chất mangkhử trùng là 10-5, 10-6, 10 -7 và đối với phânvi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng là 10-3, 10-4và 10-5.
3.2.4.1. 2.Cấy mẫu:
Dùng pipetvô trùng lấy từ dịch mẫu pha loãng 10-5, 10-6, 10-7đối với phân vi sinh vật trên nền chất mang khử trùng và 10-3, 10-4,10-5 đối phân vi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng một lượngdịch là 0,05 ml (1 giọt) cấy vào 1 đĩa petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn(xem 3.2.2.1). Mỗi mẫu pha loãng được cấy lặp lại trên 3 đĩa petri.
Dùng que gạtvô trùng gạt đều dịch mẫu trên bề mặt thạch, đợi khô và úp ngược hộp petri sauđó đưa vào nuôi ở điều kiện kị khí (*) trong thời gian và nhiệt độthích hợp với từng loại vi sinh vật.
Đếm số lượngkhuẩn lạc đặc trưng của mẫu giống vi sinh vật trên mỗi đĩa petri.
Mật độ visinh vật trên một đơn vị kiểm tra (ml) được tính theo công thức sau:
| a x 20 A = ...................... d |
Trong đó:
A: Mật độ visinh vật cố định nitơ trên đơn vị kiểm tra (g hoặc ml)
a: số khuẩnlạc trung bình có trong đĩa petri
d: nồng độdịch pha loãng
Ghi chú: Số lượng khuẩn lạc trung bình được tính là trungbình cộng số khuẩn lạc của các đĩa petri được câý từ cùng một độ pha loãng,trong đó chỉ tính các đĩa petri chứa từ 5-50 khuẩn lạc. Số lượng khuẩn lạctrung bình cũng có thể được tính là trung bình.
Cộng số lượngkhuẩn lạc của các đĩa petri được cấy từ hai độ pha loãng kế tiếp nhau bằng cáchtính số khuẩn lạc trung bình cộng ở mỗi độ pha loãng, trong đó số khuẩn lạc ởđộ pha loãng cao hơn được nhân với 10, sau đó lấy trung bình cộng của hai giátrị trên nếu tỷ số giữa giá trị lớn và giá trị nhỏ không lớn hơn 2. Nếu tỷ sốnày lớn hơn 2 thì lấy giá trị nhỏ làm kết quả. Mật độ vi sinh vật trên một đơnvị kiểm tra được biểu thị bằng một số giữa 1,00 và 9,99 nhân với 10n,n là số mũ thích hợp.
(*): Có thểsử dụng một trong các phương pháp tạo điều kiện kị khí sau:
Loại bỏ oxibằng phương pháp vật lí:
Tủ nuôi kịkhí hoặc
Bình hút ẩmcó vòi hút chân không, hàn kín bằng vadơlin, không khí trong bình được hút ravà thay bằng hỗn hợp khí CO2, N2, H2 (bìnhchân không). Để loại bỏ oxi một cách triệt để, trước đó nên đặt vào trong bìnhcác cốc đựng chất hấp thụ oxi như dithionit, clorua đồng, iot... Có thể làmgiảm tác dụng của oxi bằng cách thêm vào môi trường dinh dưỡng các chất khử oxinhư axit thioglycolic (0,3 ml/l) và systein (0,75 g/l).
Loại bỏ oxitrong không khí bằng phương pháp hoá học:
Bình nuôi kịkhí Gas Pak.
Sử dụng dungdịch xanh metylen-NaOH-glucoza: Trộn đều 3 dung dịch với 1 lượng bằng nhau (6mlNaOH 10N trong 100ml nước cất; 3,0ml xanh metylen 5% trong 100ml nước cất và 6gglucoza trong 100ml nước cất có bổ sung một chút thymol kết tinh) rồi cho vàoống nghiệm và đun cách thuỷ đến mất màu. Đặt ống chỉ thị này vào thiết bị nuôicấy kín. Ống chỉ thị sẽ tạo ra tình trạng yếm khí trongthiết bị (ôxy được khử hoàn toàn khi màu xanh của dung dịch chỉ thị bị biến mấtvà không tái hiện trở lại).
Nuôi cấytrong môi trường làm ngập kép: Dịch pha loãng mẫu được trộn với môi trườngthạch dinh dưỡng phù hợp với từng loại vi sinh vật sau khi khử trùng đã đểnguội đến 40 - 450C và đổ vào đĩa petri. Sau khi thạch đông đổ thêmmột lớp thạch - nước vô trùng (nguội đến 40 - 450C). Ủcác đĩa thạch ở nhiệt độ thích hợp.
3.2.4.2.Kiểm tra mật độ vi sinh vật kị khí phân giải xenlulo:
3.2.4.2.1.Pha loãng mẫu:
Xem3.2.4.1.1
3.2.4.2.2.Cấy mẫu:
Xem3.2.4.1.2
Phát hiệnvòng phân giải: Sau khi khuẩn lạc vi sinh vật đã phát triển trên đĩa petri chứamôi trường kiểm tra, để đĩa petri vào tủ lạnh trong 12 giờ. Sau đó cho vào tủấm 400C trong 6 giờ. Lấy ra, cho vào mỗi đĩa petri 5ml thuốc thửlugon, tráng đều khắp mặt thạch, để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết thuốc thửlugon đi. Đếm số khuẩn lạc trong đĩa petri tạo vòng phân giải (vòng trong suốt)bao quanh khuẩn lạc.
Tính toánkết quả: xem 3.2.4.1.2
Phụ lục
I/ Môi trườngkiểm tra vi sinh vật cố định nitơ kị khí:
1. Môi trường1:
Nước cất 1000ml
Glucoza 20,0g
K2HPO4 1,0g
MgSO4.7H2O 0,5g
NaCl vết
FeSO4.7H2O vết
MnSO4.5H2O vết
CaCO3 40,0g
Axit ascobic 1,0g
E.D.T.A. (Trilon B) 1,0g
Thạch bột 15,0g
2. Môi trường 2:
Nước chiết khoai tây(*) 1000ml
Glucoza 20,0g
K2HPO4 0,2g
MgSO4.7H2O 0,2g
Axit ascobic 1,0g
CaCO3 3,0g
Thạch bột 15,0g
(*) Nước chiết khoai tây: Khoai tây:200,0g
Nước cất: 500ml
Khoai tây gọt vỏ, cắt nhỏ, đun sôitrong 15 phút, lọc trong, bổ sung đủ 1000ml
II/ Môi trường kiểm tra vi sinh vậtphân giải xenlulo kị khí:
1. Môi trường3:
Nước máy 1000ml
NaNH4HPO4 1,5g
KH2PO4 0,5g
NaCl 0,1g
K2HPO4 0,5g
MgSO4.7H2O 0,4g
Pepton 5,0g
CaCO3 2,0g
Dung dịch MnSO4.5H2O1% 1 giọt
Dung dịch FeSO4.7H2O1% 1 giọt
CMC 20,0g
Thạch bột 15,0g
pH: 7,0-7,4
Môi trường 4:
Nước máy 500ml
Nước thịt-pepton 500ml
CaCO3 2,0g
CMC 15,0g
Thạch bột 15,0g
pH: 7,0-7,4
3/ Môi trường 5:
Nước máy 900ml
Nước chiết nấm men 100ml
Glucoza 0,5g
Pepton 5,0g
CMC 3,0g
Thạch bột 15,0g
pH: 7,4
